PNU-120596 AChR Modulator

PNU-120596 increases agonist (Ach)-evoked calcium flux mediated by an engineered variant of the human α7 nAChR. This compound increases agonists (choline and ACh)-evoked currents mediated by wild-type receptors and also demonstrates a pronounced prolongation of the evoked response in the continued presence of agonist in Xenopus oocytes. It increases the channel mean open time ofα7 nAChRs but has no effect on ion selectivity and relatively little, if any, effect on unitary conductance. When applied to acute hippocampal slices, this chemical increases the frequency of ACh-evoked GABAergic postsynaptic currents measured in pyramidal neurons; this effect is suppressed by TTX, suggesting that it modulates the function of α7 nAChRs located on the somatodendritic membrane of hippocampal interneurons. [1] Besides the positive modulation to α7 nAChR, this compound induces a profound retardation of the kinetics of desensitization, raising the potential of Ca²⁺-induced toxicity through excessive stimulation of α7 nAChR. [2] It causes changes in cysteine accessibility at the inner beta sheet, transition zone and agonist binding site while binding to α7 nAChR. Binding sites for this chemical are not in the agonist-binding sites and it enhances agonist-evoked gating of nicotinic receptors by eliciting conformational effects that are similar but nonidentical to the gating conformations promoted by Ach. [3]

Ca²⁺-Fluoreszenz-Assay

SH-EP1 menschliche Epithelzellen, die eine Variante des α7 nAChR (α7^*) exprimieren, werden in minimalem essentiellem Medium (MEM) kultiviert, das nicht-essentielle Aminosäuren enthält und mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 250 ng/mL Fungizone, 400 μg/mL Hygromycin B und 800 μg/mL Geneticin ergänzt ist. α7^* ist eine Variante des humanen α7 nAChR mit zwei Punktmutationen in der ersten Transmembrandomäne (T230P und C241S), die eine hohe funktionelle Expression in SH-EP1-Zellen ermöglichen [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Die Zellen werden in einem 37 °C Inkubator mit 6% CO₂ kultiviert. Die Zellen werden trypsinisiert und in 96-Well-Platten mit dunklen Seitenwänden und klaren Böden in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Well 2 Tage vor der Analyse plattiert. Die Zellen werden mit einer Mischung aus Calcium Green-1 AM in wasserfreiem Dimethylsulfoxid und 20% Pluronic F-127 beladen. Dieses Reagenz wird direkt zum Wachstumsmedium jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 2 μM Calcium Green-1 AM zu erreichen. Die Zellen werden dann 1 Stunde lang bei 37 °C in dem Farbstoff inkubiert und anschließend viermal mit Mark's modifizierter Earle's Balanced Salt Solution (MMEBSS) gewaschen, die aus folgenden Bestandteilen besteht (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-Glucose, 20 Tris-HEPES und 120 N-Methyl-D-Glucamin, pH 7.4. Nach dem vierten Zyklus werden die Zellen mindestens 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Das endgültige Volumen von MMEBSS in jeder Vertiefung beträgt 100 μL und Atropin wird allen Vertiefungen für eine Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt. Ein fluorometrischer Imaging Plate Reader (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) wird so eingestellt, dass er Calcium Green bei 488 nm mit 500 mW Leistung anregt und die Fluoreszenzemission von >525 nm misst. Eine Belichtungszeit von 0.5 Sekunden wird verwendet, um jede Vertiefung zu beleuchten. Die Fluoreszenz wird mit einem F-Stop-Wert von entweder 2.0 oder 1.2 detektiert. Nach 30 Sekunden Basismessung werden Testverbindungen in 50 μL einer 3 × Stammlösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzugefügt. In jedem Experiment werden vier Vertiefungen als Vehikel (0.2% DMSO)-Kontrollen verwendet.

Systemic administration of PNU-120596 (1 mg/kg) to rats improves the auditory gating deficit caused by amphetamine, a model proposed to reflect a circuit level disturbance associated with schizophrenia. [1] When administered prior to Carrageenan, 30 mg/kg of this compound significantly blunts mechanical hyperalgesia and weight bearing deficits for up to 4 hours. This chemical attenuates the carrageenan-induced increase in levels of TNF-α and IL-6 within the hindpaw oedema, diclofenac only attenuated IL-6 levels. Established mechanical hyperalgesia induced by Carrageenan or CFA is also partially reversed by this agent. [4]